분자발생학 강의 2000-2 중간고사를 위한 정리 요약
프로모터 구조 해석을 위한 Assay System에 대한
궁리
목적 : 프로모터의 구조 해석
재료 : 프로모터
기능 : 전사 여부
분석 :
산물의 측정. Detection, Measurement, Quantitation.
희소 산물의 농도 측정. Radioactive Substance의 이용. Liquid Scintillation Counter(LSC)이용.
기기분석
어떻게 방사능 표지?
재료인 NTP에 대한 궁리. UTP에 표지. 첫 번째 인산의 P가 표지된 P여야.
어떻게 RNA 합성?
Oocyte Injection, Fibloblast에 도입.
이는 결국 In Vitro Transcription으로 발전.
RNA Polymerase, NTP(UTP*), Template DNA, 기타. 반응(Incubation).
반응 후의 문제?
세포추출물(Cell Extract)의 방사능을 LSC로 측정하기 전에 RNA의 분리가 필요, 왜?
Backgoround를 빼기 위해선 결국 Control 또는 Mock이 측정해야 할 Sample 외에 더
필요.
이는 어떻게 구성해야?
Preparation of Promoter-Gene DNA Construct
이러한 개념을 Gene Cloning.
수많은 유전자의 혼합에서 특정 유전자를 분리해 내는 이 기술은 분자생물학의 꽃.
흔하게 사용되는 기술은 DNA Homology를 이용하는 것. DNA는 상보성(Complementarity)의
개념에 의해 다른 DNA와 결합하는 성질이 있으므로 이를 이용, 특정 DNA단편을 Probe로
삼아 이에 상응하는 상동성 DNA를 찾아낼 수 있다.
실험의 Design
일반적으로 사물을 증명하는 방법으로 두 가지 접근이 알려져 있다.
Positive Approach : ABCD→Z, ABCDE→Z' 그러면 E→△Z
Negative Approach : ABCDE→Z, ABCD→Z', 그러면 E→△Z
생물 실험의 대부분은 비교를 통하여 무엇인가를 주장하게 된다.
그림을 그리게 되면,여백이 문제가 되고, 양각으로 조각을 하려면 여백을 파내야
한다.
이러한 개념을 생물실험에서는 Control 실험이라고 부른다.
Positive Control, Negative Control의 두 가지가 있을 수 있다.
관찰할 수 있는 결과 또는 산물(Product)이 반드시 관찰되거나 검출되어야 하는 경우(Positive
Control)와
그렇지 않아야 하는 경우(Negative Control)가 이에 해당한다.
Cloning 된 예상 Promoter DNA Fragment에 대한
조작
Preparation of a Series of Deletion Mutants
끊어 제거하기 위해선 반드시 Restriction Enzyme이 인식하는 특정 DNA Sequence가
존재해야 한다.
어떠한 Deletion Mutant를 만들 것인가?
그 구상과 예상되는 결과는?
교과서에는 이러한 실험의 결과로서 유전자 앞 109bp가 프로모터로서 중요함을 알게
되었다고 말하고 있다. 이 결과를 갖고 말한다면, 앞의 예상도는 어떻게 그려지겠는가?
In Vitro Mutagenesis
더 자세히 분석하기 위해서는 어떤 접근을 해 볼 수 있겠는가?
Substitution Mutant의 제작
사용한 DNA 단편에 대한 교과서 396페이지 중단의 설명은 이전의 그림 10.1의 설명과는
일치하지 않는다. 이유는 뭣인가?
염기 C를 T로 바꾸는 방법에 대한 설명.
비특정 염기를 어떤 염기로 바꾸는 방법은 무엇인가?
특정 DNA Sequence를 다른 특정 DNA Sequence로 바꾸는 방법은 무엇인가?
Transfection.
외부의 DNA 단편을 세포 내부에 도입하는 방법
어떤 세포를 대상으로 택할 것인가?
그 방법은?
세포 배양액 중에는 NTP(UTP*), 여러 조작한 DNA 단편을 도입, 일정 기간 배양,
그 후 세포추출물 마련, RNA 분리, 방사능 측정.
NTP(UTP*)와 RNA를 분리하는 방법은?
실험의 결과는 그림 10.5에 요약.
특정 DNA 부위, 3 Cluster가 중요함을, Sequence가 중요함을 알게 되었다.
이 같은 특정 Sequence를 인식하는 어떤 단백질이 전사에서는 중요한 역할을 하게
될 것이다.
이는 후에 전사인자로서 알려지게 되었다.
분자생물학 학회 소식
Proteomics, Proteome,
2D Electrophoresis, Isoelectric Focusing, PI, SDS PAGE, Image Analysis, Mass
Spectrometry
생존에 최소한의 유전자를 갖춘 인위적인 미생물을 만들어 내고자 하는 연구.
Promoter의 기능
Mouse Metallothionein-1 유전자의 Promoter에 Rat의 Growth Hormone 유전자를 융합시킨
DNA Construct를 Mouse의 Egg Pronucleus에 Injection, Transgenic Mouse를 만들어
Promoter의 기능을 알아보기로 하였다.
단백질 Metallothionein-1의 기능은 무엇인가?
이 유전자의 전사는 어떻게 조절되는가?
단백질 Metallothionein-1과 Growth Hormone은 각각 몸의 어떤 부위에서 만들어지는가?
사진의 크게 자란 마우스는 도입된 Rat Growth Hormone 유전자를 때문인가? 아니면
아연이 포함된 먹이로 키운 탓인가? 이 둘을 구별하려면 어떤 실험을 해 보면 되겠는가?
실험의 예상되는 결과는?
Rat Growth Hormone은 Mouse의 체내에서 어떤 메커니즘을 거쳐 Mouse에 영향을 끼치게
되겠는가?
이 실험에서 얻은 결론은 무엇인가?
고가의 단백질 생산
폐기종은 폐포의 벽이 터져 형성된 기강(氣腔)으로 호흡 부전(不全)이 일어나는 병이다.
이는 폐포 속에 있는 탄력섬유가 단백질가수분해효소에 의해 분해됨으로써 일어난다.
단백질 (1-antitrypsin(AAT)은 단백질가수분해효소의 작용을 방해함으로써 폐기종의
진행을 막게 된다.
Human AAT를 젖 속에 분비하는 양을 만들어 고가의 AAT를 생산하고자 한다.
어떤 DNA Construct를 마련하면 좋겠는가?
Transgenic Sheep은 어떤 과정을 통해 만들게 되는가?
DNA를 주입한 Egg를 자궁에 이식하고, 이입된 유전자를 갖고 태어난 새끼는PCR 검사를
통해 가려내게 된다. 그러나 외부 유전자가 이입될 확률은 높지 않다. 그리고 한
마리의 양에서 태어나는 새끼는 많지 않다. 수십 마리의 새끼 양을 검사해도 Zero일
경우를 각오해야 할 것이다. 어떻게 하면 낮은 확률의 문제에 의해 쓸 데 없이 새끼양이
태어나는 문제를 피할 수 있을 것인가. 태어난 새끼양을 외부에 판다는 것도 힘들
것이고, 키운다 하면 연구소가 경비 부담으로 문을 닫거나 연구자가 목동이 되어야
할 판일 것이다.