분자발생학 강의 99-2 요약

Promoter Function

Metallothionein Promoter 와 Rat Growth Hormone 유전자를 fusion 시킨 다음 이를 mouse에 도입해 봄으로써 Promoter 의 기능을 알 수 있었다.
구체적인 실험 기법은 무엇인가?

• 유전자의 조작을 행한다.
• 적절한 vector에 도입, bacteria 에 형질전환하여 증폭시킨다.
• 현미경과 micromanipulator를 이용하여 적절한 copy 수(數)를 수정란의 전핵에 주입(注入)한다.
• 분열 중인 embryo를 골라 자궁에 이식한다.
• 태어난 새끼 중에서 그 염색체 속에 target DNA를 갖게 된 새끼를 Southern Hybridization 이나 PCR 기법에 의해 골라낸다.
• Zinc 가 든 먹이를 먹여 키운다. 보통의 mouse보다 80% 이상 더 자라는 것을 관찰한다.
• 쥐를 해부하여 간과 뇌하수체 속의 Rat Growth Hormone 농도를 측정해 본다.
  

Metallothionein Promoter의 특성이란 무엇인가? 또는 Metallothionein Protein이란 어떤 단백질인가?
이 실험에서 Metallothionein Promoter를 실험 대상으로 택한 이유는 무엇인가?

보통 mouse보다 80% 이상 더 자랐다는 것은 무엇을 의미하는가?
쥐를 해부하여 간과 뇌하수체 속의 Rat Growth Hormone 농도를 측정해 본 결과는 어떠했는가?
왜 수많은 조직 중 간과 뇌하수체만을 문제시 삼는가?
이 결과로부터 Promoter의 기능이란 어떻게 설명할 수 있는가?

폐기종 치료에 사용되는 단백질인 a1-antitrypsin을 젖 속에 분비하는 염소를 만들어 내고자 한다.

어떤 식으로 유전자를 조작하겠는가?
재조합된 유전자를 갖고 태어나는 염소는 어떻게 만들 수 있는가?

이상은 중가고사 범위에 속한 것이었으므로 이하부터 기말고사 시험 범위로 함.

전사기본장치에 관한 설명
그림 10.8과 그림 10.9

TATA box란?
TBP란?
TFⅡD란?
TFⅡH에 의한 RNA Polymerase의 CTD Phosphorylation은 어떤 결과를 초래하는가?
TFⅡH의 Serine/Threonine Protein Kinase Activity란 무엇을 의미하는가?
멀리 떨어져 있는 조절 부위에 결합하는 전사인자는 어떻게 하여 전사기본장치의 전사를 활성화시키게 되는가?

Enhancer의 요구
그림 10.11

Myeloma란?
항체 단백질의 구조?
항체 Heavy Chain 유전자의 구조?
항체 유전자의 재배열이란?
Class Switching이란?

나는 이 분야의 연구로 유명한 Honjo Tasuku 교수로부터 박사학위논문의 지도를 받았다. 사부님의 저서(著書), Immunoglobulin Genes, 2nd Ed, 1995, Academic Press는 이 분야의 연구를 잘 Review해 두고 있는 좋은 책이다. 선생님께 고마움을 표하면서 동시에 못난 제자임이 부끄럽다.

Transfection이란?
1980년대의 분자생물학은 분자면역학이 이끌었다고 해도 과언이 아닐 것이다. 분자면역학이 분자생물학을 선도하게 된 이유는 무엇이겠는가?
Immunoglobulin 유전자의 Cloning은 다른 유전자에 비해 비교적 빨리 이루어질 수 있었다. 그 이유는 무엇인가?
이 실험에서 Negative Control에 해당하는 것은 무엇인가?
이 실험에서 Positive Control에 해당하는 것은 무엇인가?
mRNA의 추출방법은?
Northern Blotting이란?

Enhancer의 기능
그림 10.12

Promoter나 Enhancer의 기능을 알아보는 편리한 방법이 개발되었다. Reporter Gene으로 CAT를 사용함으로써 전사의 정도를 쉽게 알 수 있게끔 한 이 방법은 흔히 CAT Assay라고 부른다. CAT는 무엇의 약어(略語)인가?
구체적으로 어떻게 조작한 유전자를 진핵세포에 Transfection하게 되는가?
CAT Assay에서 효소 CAT의 Activity는 구체적으로 어떻게 검출하는가?
PBS는 무엇의 약어(略語)인가?
Microfuge Tube란 무엇인가?
Aliquot란 말의 의미는?
TLC는 무엇의 약어(略語)인가?
방사능의 양(量)을 수치로 측정해 주는 기기의 이름은?
방사능 물질이 존재하는 위치를 시각화(visualization)하기 위해서는 어떻게 하면 되는가?
Autoradiograph란?

췌장에서 내분비되는 단백질, 예를 들어 Insulin과 외분비되는 단백질, 예를 들어 Chymotrypsin의 발현을 조절하는 Enhancer는 서로 같지 않다. 각각의 Enhancer에 의해 외분비 단백질과 내분비 단백질의 발현이 조절된다는 것을 실험으로 증명하고자 한다. 어떻게 실험을 디자인할 수 있겠는가?

• Insulin 유전자와 Chymotrypsin 유전자의 Enhancer를 각각 Cloning 한다. 구체적으로는 어떻게 하는가?
• CAT 유전자에 각각 연결시키는 유전자 조작을 행한다.
• 이를 적당한 세포주에 Transfection한다. Transfection하는 이유는 Enhancer에 결합하는 전사인자의 필요성 때문이다. 이때 선택해야 하는 세포주(Cell Line, 細胞株)는?
  
• 이 실험에서 Negative Control과 Positive Control로서는 각각 어떠한 것을 사용하면 좋겠는가?
  
  
• 실험이란, 실험을 행하기 전에 실험의 결과를 예측한 후, 실제로 실험을 행하여 얻게 된 결과와 당초의 예측을 비교하여, 예측대로의 결과가 나온 경우에는 확신을, 예측에 반하는 결과가 나온 경우는 생각의 수정을 행하게 되는 지적(知的)인 활동이라고 말할 수 있을 것이다. Enhancer가 조직특이적인 발현을 조절할 것이란 선입견을 만약 연구자가 갖고 있다고 한다면, 이 연구자는 위와 같은 실험의 디자인을 통해 어떠한 결과가 나올 것으로 기대하고 있을 것인가?
  
  
• 세포를 배양하여 CAT 유전자의 발현을 허락한다.
• 세포를 수확한다.
• CAT Assay를 행한다.
• Negative Control의 의미로서 사용한 세포주에서는 어떠한 Autoradiograph가 나오겠는가?

Consensus Sequence란?

그림 10.13
yp1,yp2유전자는 언제 어디에서 발현될 것인가?

전사인자는 일단 DNA에 결합하는 능력이 있어야 하며, 다음에는 전사기본장치와 Interaction하여 전사를 활성화시키는 능력이 있어야 한다. 그러므로 전사인자는 DNA-binding Domain과 Trans-activating Domain의 두 부분을 갖게 된다. DNA에 결합하는 능력은 Gel Mobility Shift Assay(Gel Retardation Assay)로 쉽게 알아낼 수 있다. 전사활성화 능력은 어떤 실험을 통해 알아낼 수 있는가?

그림 10.24에서
이 실험에서 사용한 Octamer란 어떤 것인가? 좀더 상세히 짐작해 보라. Nonspecific binding이란 무슨 뜻인가?
특이적으로 결합하는 단백질은 전사인자일 가능성이 있으므로 Gene Cloning을 시도해 볼 수 있을 것이다. 어떤 방법을 사용하면 Cloning에 성공할 수 있을 것인가?

1. 단백질을 분리, 정제하여 Amino Acid Sequence를 정한 다음, 시도해 볼 수 있는 방법이 있을 것이다.
2. Expression Library의 Screening을 통하는 방법이 있을 수 있을 것이다.

DNA결합 단백질의 Cloning에 성공했다고 가정하자. Expression Vector를 이용한 단백질 생산에도 성공했다고 가정하자. 이 단백질은 Gel Mobility Shift Assay에 사용한 DNA Fragment에 결합하는 능력으로 인해 발견되었다. 이 단백질은 실험에 사용한 DNA Fragment의 그림 10.24라면, Octamer Sequence에 결합할 것이 기대된다. 그러나 과연 그럴 것인가? 물론 DNA Fragment에는 Octamer Sequence만이 존재하는 것은 아니다. 다른 DNA Sequence도 포함되어 있다. 어떤 부분에 결합할 것인지 확인해 보고 싶은 생각이 들 경우에는 어떻게 하면 확인할 수 있겠는가?

그림 10.25
외부로부터의 신호 전달에 세포가 반응하는 것 중에는 유전자의 전사도 포함될 수가 있다. 바이러스의 침입이나 Lipopolysaccharide(LPS), Tumor Necrosis Factor, 항원의 결합이라는 신호에 의해 항체, TNFa, IL-2 등이 B 세포 특이적으로 만들어 지게 된다. 이들 유전자의 발현에는 B 세포 특이적으로 발현하는 전사인자, NF-kB가 관여한다. 세포질 내에 존재하는 불활성의 NF-kB는 신호를 받게 되면 활성화되어 핵 내로 이동하게 되고, 해당 Promoter와 Enhancer에 결합하게 되면 그 하류에 있는 항체, TNFa, IL-2 유전자의 전사를 일으키게 된다.

그림 17.6
외부로부터의 신호전달에 의해 세포질에서 핵 내로 이동하게 되는 전사인자에는 Suppressor of Hairless도 있다. 이 전사인자는 훨씬 간단한 단계를 거쳐 외부의 신호를 전달 받는 특징이 있다. 강의 담당 교수인 나는 박사학위 과정 중 이 전사인자를 주로 연구하였다. 그림에서 보이는 것처럼 Suppressor of Hairless가 Homodimer로서 Target DNA에 결합한다는 것을 Gel Mobility Shift Assay(Gel Retardation Assay)를 통해 밝혀 내었다.

어떠한 실험을 통해서 밝혀 내게 되었는가?

• Deletion Mutant의 유전자를 유전자 조작에 의해 만들어 낸다.
• Expression Vector에 도입한 후, 적절한 세포에 Transfection 하여 길이가 짧아진 단백질을 생산시킨다.
• 세포를 수확하여 Cell Extract를 만든다.
• 방사능 표지(標識)한 DNA Probe와 섞어서 Incubation 한 다음, Gel Mobility Shift Assay(Gel Retardation Assay)를 행한다.
• 어떤 식으로 각 Lane에서 흘릴 단백질을 정할 것인가? 그리고 예상되는 결과는 어떤 Band Pattern일 것인가? (만약 Monomer 상태로 결합하는 경우라면 Autograph에서 어떤 Band Pattern이 나타날 것인가? 만약 Homodimer 상태로 결합하는 경우라면 Autograph에서 어떤 Band Pattern이 나타날 것인가?)

전사인자, Homeodomain Protein이란?
Homeobox란?

수많은 질문에 제대로 답하지 못했다고 해서 자신을 닦아세울 것은 없습니다. 저도 많은 훈련 끝에 이런 식으로 된 것이지 처음부터 이런 일을 잘했던 것은 아닙니다. 기죽지 말고 학생 여러분의 매진이 있기를 당부합니다.