생물기기분석 실험 2

1. 제목 : 미생물의 액체 배양-2

2. 목적 :

(1) 미생물을 배양할 때, 배지에 첨가한 탄소원 농도의 변화를 이해

(2) DNS 방법을 사용한 환원당 측정의 원리를 이해

(3) 포도당 표준 용액을 제조하고 표준곡선 (standard curve)을 작성

(4) 표준곡선을 이용하여 미지 시료의 환원당 농도를 계산하는 원리를 이해

3. 기구 및 시약 :

(1) DNS 시약

   1) DNS 시약의 제조

        a. 10.6g의 3,5-Dinitrosalicylic acid와 19.8g의 sodium hydroxide (NaOH)를 1,416 ml의 DW에 천천히 녹인다 (NaOH의 발열반응에 주의).

        b. 위 용액에 306g의 sodium potassium tartrate (Rochelle salts)를 천천히 녹인다.

        c. 7.6 mL의 페놀 (고체 상태를 따뜻한 물로 녹인 액체 페놀)과 8.3g의 sodium meta bisulfite (Na₂S₂O₅)를 천천히 녹인다.

   2) 표준곡선 작성 및 시료 측정

        a. 포도당의 농도가 0.0 ~ 0.5 mg/mL (500 μg/mL)인 표준용액을 제조한다.

        b. 포도당의 표준용액 1 ml과 DNS 시약 3 ml을 혼합한 후, 끓은 물에서 5분간 반응시킨다.

        c. 수돗물을 사용하여 반응액을 실온으로 식힌 후에 550 nm에서 흡광도를 측정하여 포도당 농도에 대한 표준곡선을 작성한다.

        d. 미지 시료를 위와 같은 방법으로 반응시켜 흡광도를 측정한 후에 표준곡선을 사용하여 환원당의 농도를 측정한다.

   3) 발생반응 원리

(2) DNS 방법의 주의 점

   1) 발색반응은 시료가 알칼리 상태에서 나타나므로 시료의 pH를 중성으로 조절한다.

   2) 측정하고자하는 환원당의 종류에 따라 표준곡선을 작성하여야 한다 (xylose의 농도를 측정할때는 xylose를 사용하여 표준곡선을 작성한 후에 농도를 계산).

4. 실험 방법

(1) 표준곡선 (Standard curve) 만들기

   1) glucose를 아래 농도의 표준당 용액을 희석하여 농도별 용액을 만든다.

       a. 표준당 용액의 농도 : 1.0 mg/mL (1,000 μg/mL)

        b. 아래와 같은 기본표를 사용하여 필요한 양의 표준용액을 제조한다.

   2) 농도별 용액 1 mL과 DNS 시약 3 mL을 혼합한다. (반응비율 1 : 3)

   3) 100℃의 water bath에서 약 5분~10분간 중탕한다.

   4) 발색반응을 확인 후 냉각시킨다.

   5) spectrophotometer를 이용하여 550nm에서 측정한다.

   6) 측정된 값을 이용하여 standard curve를 작성한다.

(2) 미지시료의 환원당 측정

   1) 미지시료 1 mL에 DNS 시약 3 mL을 혼합한 후에 위의 방법과 같이 실험을

       진행하고 표준곡선을 이용하여 환원당의 농도를 계산한다.

   2) 배양 초기의 환원당 농도를 고려하여 희석한 후에 환원당을 측정한다.

5. 결과 및 토의

(1) 환원당의 측정 원리에 대하여 이해한다.

(2) 표준곡선을 작성할 때의 주의 점에 대하여 토의한다.

(3) 미지 시료의 농도를 표준곡선을 사용하여 계산한다.

6. 환원당 측정의 예