생물기기분석 실험 3
1. 제목 : Bradford법에 의한 단백질 정량
2. 목적
(1) Bradford법에 의한 단백질의 정량방법을 습득
(2) Bradford법에 의하여 표준곡선을 작성하고 미지 시료의 단백질 농도를 추정
3. 기구 및 시약 :
(1) 표준 단백질: 0.1 mg/mL (0.1 µg/µL) bovine serum albumin (BSA)
(2) Bradford stock solution (5배 농축액): 100 mL의 95% ethanol, 200 mL의 88% phosphoric acid 및 350 mg의 commassie brilliant blue G-250을 섞어서 제조한다. Whatman No. 1 filter paper로 여과하여 유리용기에 실온에서 보관한다. 안정성은 2주까지 유효하다.
(3) Bradford working buffer: 425 mL의 DW, 15 mL의 95% ethanol 및 30 mL의 Bradford stock solution을 섞어서 제조한다.
(4) Spectrophotometer, voltex mixer
4. 실험 방법
(1) 표준곡선 작성을 위하여 BSA의 농도가 0, 20, 40, 60 및 80 µg/mL의 BSA 용액을 제조한다.
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농도 |
0 µg/mL |
20 µg/mL |
40 µg/mL |
60 µg/mL |
80 µg/mL |
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BSA (㎕) |
0 |
200 |
400 |
600 |
800 |
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DW (㎕) |
1,000 |
800 |
600 |
400 |
200 |
(2) 각 농도별 BSA 용액 100 µL와 1 mL의 Bradford working buffer를 섞은 후에 실온에서 5분간 반응시킨다.
(3) 발색을 확인한 후에 595 nm에서 흡광도를 측정한다.
(4) 미지의 시료의 정량
1) 미지 시료도 동일한 비율로 Bradford working buffer와 섞은 후에 동일한 조건에서 반응시킨 후에 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정한 흡광도를 참고로 미지시료의 단백질양을 계산한다.
2) 미지 시료의 농도가 표준곡선 상의 농도범위 이상 될 경우를 고려하여 완충춍액 또는 증류수 등으로 희석하여 정량한다 (2배, 5배 및 10배 희석)
5. 결과 및 토의
(1) Bradford법의 원리
산성용액에서 Commassie brililiant blue G-250은 단백질과 결합하면 최대 흡광도가 465 nm에서 595 nm로 이동한다. 즉, 595 nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례한다. 발색반응은 2분이내이며 발색의 안정성 1시간 정도 유효하다. Bradford법의 감도는 Lowry법에 비하여 높으며 미량정량법을 적용할 경우 1~20 µg 정도의 단백질양도 측정할 수 있다.
(2) Commassive brililiant blue G-250의 구조
(3) 표준곡선이 적당한 농도에서 작성되어 흡광도와 농도가 정비례하는지 확인
6. 실험상의 주의점: 일반 분석 실험과 동일
7. 참고사항: 단백질의 정량법
(1) 자외부 흡수법
단백질에 포함되어 있는 tryptophan, tyrosine 및 phenylalanine 등의 아미노산이 280 nm 파장의 빛을 잘 흡수하는 원리를 이용한 정량법이다.
(2) Lowry법
Lowry법은 phenol 시약 (인산 몰리브텐과 인산 텅스텐)과 단백질 중에서 방향족 아미노산 (tryptophan과 tyrosine)으로 유래하는 정색반응을 측정하여 단백질을 정량하는 방법이다.
(3) Lowry-Folin법
가장 널리 사용되는 단백질 정량법의 한가지로 감도가 좋아 10 µg/mL 범위에서 측정이 가능하며 buret법의 100 배 및 자외부 흡수법의 10~20배의 감도로 측정이 가능하다. 측정방법의 원리는 알카리성으로 구리이온과 단백질이 buret 반응에 의하여 발색하는 것과 인산 몰리브덴이 단백질 중에서 tryptophan과 tyrosine에 의하여 환원되어 인산 몰리브덴이 청색을 나타내는 것에 기초를 두고 있다.
(4) Buret법
Buret법은두 가지 이상의 peptide 결합이 존재하는 경우에 알칼리성 쪽에서 CU2+와 착염을 형성하여 안정한 발색반응을 나타내는 원리를 이용하는 방법이다. 이 방법은 1~10 mg/mL의 비교적 높은 농도의 단백질 정량에 적합한 방법이다.