생물기기분석 실험 6

1. 제목 : 미생물이 생산하는 섬유소 분해효소의 섬유소 분해 활성 측정

2. 목적

(1) 미생물이 생산하는 섬유소 분해효소의 효소작용 기작 이해

(2) 환원당 측정을 위한 DNS 방법의 이해 및 적용에 대한 이해

(3) 섬유소 분해효소의 작용에 의하여 생성된 단당류 (포도당)을 DNS 방법으로 측정하여

   섬유소 분해효소의 활성을 측정하는 원리의 이해

3. 기구 및 시약 :

(1) 섬유소 분해효소

   1) 섬유소 분해효소를 생산하는 미생물을 배양

   2) 균체를 제거한 상등액을 dialysis 하여 일정 농도의 섬유소 분해효소 용액을 준비

     (포도당 및 염 등의 성분을 제거)

(2) 섬유소 분해효소의 기질 반응을 위한 carboxymethylcellulose (CMC) 용액

     (1 mg/mL)

(3) 환원당 측정을 위한 DNS 시약 (실험 2의 DNS 시약 제조 방법 참고)

(4) eppendorf tube 및 원심분리기

(5) 큐벳 및 spectrophotometer

(6) water bath 및 어름

4. 실험 방법

(1) CMC 500㎕와 각기 다른 양의 섬유소 분해효소를 첨가하고 50℃에서 20분 반응한다 (섬유소의 농도에 따라 환원당이 생성되는 양에 차이가 있다는 사실을 확인).

(2) 증류수 500㎕와 섬유소 분해효소 500㎕를 동일조건으로 반응한다 (control).

(3) 각각의 효소반응을 정지시키기 위하여 3분간 끓는 물을 채운 water bath에 넣는다.

(4) 얼음물 또는 tap water를 사용하여 반응액의 온도를 실온으로 식힌다.

(5) 각각의 효소 반응액에 존재하는 환원당을 측정하기 위하여 DNS 방법으로 발색반응을 유도한다.

(6) 각각의 효소 반응액을 spectrophotomter를 사용하여 흡광도를 측정한 후에 표준곡선을 이용하여 생성된 환원당을 계산한다. 표준곡선은 포도당을 사용하여 DNS 방법으로 발색반응을 유도하여 작성한다

(7) CMC를 기질로 사용한 반응액에서 증류수를 사용한 반응액 (control)의 농도를 밴 값으로 실제 생성된 환원당의 농도를 계산하여 unit/mL 단위의 효소 활성을 구한다.

5. 결과 및 토의

(1) 기본 원리

   1) 생성된 환원당의 양은 배양액에 생산된 효소의 양과 비례

   2) 효소의 활성단위: unit/mL

   3) 1 unit는 1분 동안 기질로부터 1 μ mol의 포도당 (0.00018 mg/mL)에 상응하는 환원당을 생산하는 효소량

   4) 효소의 활성 계산

        a. 표준곡선을 이용하여 생산된 환원당의 농도를 계산

        b. 표준곡선은 표준 농도의 포도당을 사용하여 작성 (μ mol 단위의 포도당 제조)

        c. 효소의 활성 = 측정한 환원당의 농도 (μ mol/mL) x (1/0.5) x (1/20)

                - 효소액을 0.5 mL 사용하였음

                - 반응시간이 20분이었음

(2) 표준곡선이 적당한 농도에서 작성되어 흡광도와 농도가 정비례하는지 확인

(3) 효소의 활성을 계산하는 방법이 올바른지 확인

6. 실험상의 주의점

(1) 효소 반응에 온도 유지 등에 주의

(2) 효소 반응액의 환원당 측정시 표준곡선의 범위내에 들어올수 있도록 희석 등을 고려

(3) 참고; DNS 방법

   1) 포도당의 농도가 0.0 ~ 0.5 mg/mL인 표준용액을 제조한다.

   2) 포도당의 표준용액 1 ml과 DNS 시약 3 ml을 혼합한 후, 끓은 물에서 5분간 반응시킨다.

   3) 수돗물을 사용하여 반응액을 실온으로 식힌 후에 550 nm에서 흡광도를 측정하여 포도당 농도에 대한 표준곡선을 작성한다.

   4) 미지 시료를 위와 같은 방법으로 반응시켜 흡광도를 측정한 후에 표준곡선을 사용하여 환원당의 농도를 측정한다.

7. 참고자료

(1) 섬유소 분해효소의 기작 및 DNS 방법의 원리

(2) 포도당의 산화 및 환원 (유기화학, 탄수화물 참고)