생물기기분석 실험 8

1. 제목: SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 위한 gel의 제조

2. 목적

(1) 분자량에 따라 단백질을 분리할 수 있는 전기영동에 대한 이해

(2) SDS-PAGE를 위한 gel을 만들어 전기영동을 실시

(3) 분자량에 따라 분리되는 SDS-PAGE 및 분리된 단백질의 염색 방법 및 원리를 이해

(4) 분자량을 이미 알고 있는 단백질과 비교하여 분자량 계산하는 방법의 이해

3. 기구 및 시약 :

(1) 기구

1) 전기영동 장치 및 power supply

2) micro pippete

3) latex glove

(2) 시약

1) loading buffer (sample buffer)

   a. 5배로 제조하여 저온에 보관

   b. 사용할 때, 단백질 시료의 부피를 고려하여 시료로 희석하여 1배의 농도로 사용

   c. loading buffer (for stacking gel)

2) running buffer (for running gel)     

3) 염색시약

4) 탈색시약

(3) gel 조성표

1) stacking gel (5.0% gel)

2) running gel (12.0%)

4. 실험 방법

(1) gel 판 조립

1) gel판의 앞 유리와 뒷 유리판을 깨끗이 닦는다.

2) 유리판을 맞추고 틀에 끼워서 평평하게 맞춘다.

3) 약간의 물을 넣어 세는지 확인한다.

4) 세지 않으면 물을 다시 빼내고, 샐 경우는 재조립한다.

(2) separating gel 만들기

1) 각 조성에 맞추어 separating gel을 만든다.

 ※주의 : TEMED와 APS는 제일 마지막에 넣어준다

2) 조성에 맞게 만들어진 gel을 조립한 겔판에 천천히 초록색 선까지 분주한다.

3) separating gel을 분주한 뒤 dH₂0를 천천히 넣어주어 gel이 수평이 되도록 한다.

(3) stacking gel 만들기

1) separating gel이 굳었으면 separating gel과 동일하게 겔을 만든다.

2) separating gel위에 부어놓은 물을 빼낸다.

3) 만든 Stacking gel을 천천히 분주한다.

4) 마지막으로 comb을 끼운다

(4) 실험 방법

1) 5 x loading buffer를 단백질 시료 및 분자량 marker에 첨가한다 (최종 농도 1 x).

2) 3~5 분간 끓인 후에 ice 또는 흐르는 물에 식힌다.

3) 원심분리하여 상층액만 staking gel에 loading 한다.

4) 단백질 시료 및 marker를 stacking gel의 well 속에 주입한다.

5) BPB가 running gel의 밑 부분에 올 때가지 130~150 V로 전기영동한다.

6) 조심스럽게 전기영동기에서 gel을 분리한 후에 염색시약에 담구어 30분 동안 염색한다.

7) 염색된 gel을 탈색시약에 옮겨 하룻밤 동안 탈색한다.

5. 결과 및 토의

(1) gel 판의 조립방법과 stacking gel 과 separating gel 만드는 방법의 이해

(2) stacking gel 과 separating gel이 두 부분으로 나뉘는 이유

1) taking gel 에서 단백질들을 이온에 상관없이 하나로 모아준 다음,

2) separating gel(Running gel)에서 각각의 사이즈에 따라서 분리.

(3) SDS

1) 전하를 가지며 단백질의 소수성 영역과 결합

2) SDS-protein 결합체는 - 전하를 띄게 됨

3) 고분자 단백질 시료일수록 - 전하는 많아짐

4) 즉, 고분자 단백질 시료일수록 size가 크므로 gel network에 의해 방해 받아서 늦게 이동.

(4) 표준물질 (marker)의 R_f 값을 참고로 분자량에 대한 표준곡선 작성

(5) 참고(http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_3133.pdf)

6. 실험상의 주의점

(1) acrylamide는 위험하기 때문에 장갑, 마스크를 착용

7. 참고자료 (http://xerxgus.blog.me/70025867724)

(1) SDS-PAGE의 원리

1) acrylamide와 bisacrylamide의 비율은 최소 20:1

2) bisacrylamide의 첨가 비율이 높을수록 gel의 pore size는 작아짐

(2) 전기영동에 사용되는 완충용액 (buffer)

1) loading buffer

  a. 단백질 시료를 comb로 만든 lane에 loading할 때 사용하는 buffer

  b. 단백질 시료를 loading buffer에 섞은 후에 시료를 loading해야 함

  c. SDS, 2-meracptoethanol 및 glycerol 등으로 구성되어 있음

  d. loading buffer의 역할은 단백질 시료가 물에 뜨지 않고 가라앉게 하는 역할을 함

   2) running buffer

  a. 전기영동용 buffer로서 glycine과 HCl이 포함되어 있어 용액에 전기가 잘 흐르게 함

  b. running buffer는 이동 중인 단백질 시료의 위치를 알 수 있게 함

(3) stacking과 running gel의 역할

1) stacking과 running gel은 acrylamide의 함량 차이가 있으며, pH가 다름

2) 단백질 시료를 loading한 후에 전기장을 걸면 단백질 및 이온들이 gel을 이동

3) running buffer에 존재하는 glycine 및 Cl^-이 단백질의 이동에 큰 역할을 함

4) stacking gel

  a. glycine은 net charge가 0이 되는 pI 값이 6.2인데 staking gel의 pH는 6.8

  b. Cl^-, 단백질 시료 및 glycine 등 모두가 (-)전하를 띄는데 Cl^-의 분자량이 가장 작고, glycine은 일부만 (-) 전하를 띄기 때문에 이동속도는 Cl^-> 단백질 시료> glycine 순임

  c. 전기영동에 의한 전기장뿐만 아니라 이 두 이온사이의 전기장에 의하여 두 이온 사이에 놓인 단백질 시료의 이동속도가 빠르게 되며, 그 결과 분자량의 차이에 의한 이동속도의 영향은 거의 없음

  d. 또한, acrylamide의 농도가 낮기 때문에 단백질 시료는 거의 동일한 속도로 내려감

  e. 이로 인해 단백질 시료는 일직선으로 내려가고 running gel에 들어가지 전에 같은 출발상에 위치하게 됨

5) running gel

  a. running gel은 staking gel과 달리 pH가 8.8이기 때문에 glycine이 완전히 이온화됨

  b. 이동속도가 Cl^-> glycine> 단백질 시료로 바뀜

  c. Cl^-과 glycine 사이의 전기장 차이의 영향을 받지 않음으로 단백질 시료는 각각의 분자량에 비례하여 이동

  d. 또한, running gel의 acrylamide의 농도는 staking gel의 농도보다 높으므로 단백질 시료의 이동속도의 차이를 더욱 크게 함

(4) loading sample 준비 시에 단백질 시료를 가열하는 이유

1) loading buffer에는 SDS가 포함되어 있는데 이 SDS가 단백질 시료를 둘러싸 micelle을 형성하면 단백질 시료는 단백질 시료의 크기에 비례하여 전하를 갖게 됨

2) 단백질 시료를 일자로 풀어주어야 분자량의 크기에 비례하는 전하를 갖게 됨

3) 단백질 시료를 열처리하여 꼬여있는 구조를 일자의 풀린 구조로 만들기 위함