2000년도 2학기 생물기기분석학 수업노트-8: 자외선/가시광선 분광법

생물기기분석학 수업노트-10: 자외선/가시광선 분광법

- 차 례 -

1. 개론

(1) 분광학

(2) 전자기 복사선 (elecromagnetic radiation)

(3) 전자기 복사

(4) 파장과 에너지

(5) 자외선 분광도법

2. 가시광선과 자외선 분광기

(1) 자외선과 가시광선

(2) 원리

(3) 복사선의 흡수

(4) 전자 전이의 종류

(5) 발색단 (chromophore)

(6) 조색

3. Lambert-Beer의 법칙

(1) Lambert의 법칙

(2) Beer의 법칙

(3) 문제점

4. 기기장치

(1) 광원

(2) 단색화 장치

(3) 흡수셀 (cell)

(4) 검출기 (detector)

- 강 의 내 용 -

1. 개론

(1) 분광학

1) 분자의 구조나 성질을 규명하는 여러 가지 방법 중의 하나

2) 분자 내의 에너지와 광에너지간의 상호작용을 이용하는 방법

(2) 전자기 복사선 (elecromagnetic radiation)

1) X-선, 자외선, 가시선과 같은 복사선

2) 파장의 크기에 따라 에너지의 양의 다름

3) 물질과 부딪치면 에너지의 일부가 물질에 흡수되어 그 세기가 감소

4) 분광학 (spectroscopy)

a. 분자의 구조나 성질을 규명하는 여러 가지 방법 중의 하나

b. 분자 내의 에너지와 광 에너지간의 상호작용을 이용하는 방법

(3) 전자기 복사

1) 광자(photon) 또는 양자(quanta)라고 입자가 파동형태로 공간을 통하여 전달되는 에너지

2) 파장의 증가함에 따라 또는 파수가 적을수록 에너지는 작음

3) 파장의 크기에 따라 물질에 부딪치었을 때 나타나는 현상이 다름

a. X-선

- 내부전자의 전이 (전자들의 에너지 준위가 변함)

- 질양분석기 (GC/MS)에 이용

b. 자외선 및 가시광선: 외각전자의 전이

- 외각전자들의 에너지 준위 (궤도함수)가 변함

- UV/VIS spectrometer를 이용한 물질 분석의 원리

c. 적외선: 분자진동

- 분자를 구성하는 원자의 결합길이 및 결합각의 변화

- IR spectrometer를 이용한 물질 분석의 원리

d. 마이크로파: 분자회전

e. 라디오파:

- 자기 유발된 원자의 스핀상태의 변화

- NMR (핵자기공명분석기)을 이용한 물질 분석의 원리

(4) 파장과 에너지

1) 파장 (wavelength, λ)

a. 한 파동의 정점에서 다음 파동의 정점까지의 거리

b. 단위: 미터단위 (μm, nm, Å)

2) 진동수

a. ν = C/λ

b. ν: Hz로 표시한 진동수 (주기/sec)

c. 진동수를 cm 당 주기수인 파수로 나타냄

3) 광자에너지는 파장에 역비례하며 진동수에 비례

E = hc/λ= hν

h = planck 상수

c = 빛의 속도 (3 x 10¹⁰ cm/sec)

λ = cm로 나타낸 파장

v = Hz로 표시한 진동수

(5) 자외선 분광도법

1) 전자들이 낮은 에너지 준위에서 높은 에너지 준위로 변화할 때

흡수하는 전자기 복사선 (광자)의 에너지를 측정

2) 분자가 광전자를 흡수하는 것은 그 분자속의 작은 원자단에 속하는 전자가 들뜨기 때문

3) 자외선과 가시광선을 이용한 분광광도법은 광전자를 흡수하는 발색단 즉, chromophore 기의 존재를 이용하여 분석

2. 가시광선과 자외선 분광기

(1) 자외선과 가시광선

1) 가시광선: 400 nm (보라색)에서 750 nm (적색)

2) 자외선: 100 nm부터 400 nm

3) 화합물에 의하여 흡수되는 에너지는 복사선의 파장에 역비레

4) 에너지의 양

E = hc/λ= hν

h = planck 상수

c = 빛의 속도 (3 x 10¹⁰ cm/sec)

λ = cm로 나타낸 파장

v = Hz로 표시한 진동수

(2) 원리

1) 자외선 또는 가시광선의 흡수 (에너지의 흡수)

a. 전자를 낮은 에너지 상태인 바닥상태 궤도함수로부터

b. 높은 에너지의 들뜬 상태의 궤도함수로 전이시킴 (전자전이)

2) 흡수되는 자외선과 가시광선의 파장은 전자전이의 용이성에 의존

3) 전자전이에 많은 에너지가 필요한 분자는 짧은 파장에서 흡수

4) 전자전이에 적은 에너지가 필요한 분자는 긴 파장에서 흡수

(3) 복사선의 흡수

1) 흡수

a. 자외선과 가시광선과 같은 복사선이 투명한 물질층을 통과하는 경우,

b. 특정한 주파수의 복사선이 선택적으로 감소하는 현상

2) 전자전이

a. 복사선의 에너지는 물질의 원자 또는 분자로 이동되고,

b. 원자 또는 분자의 외각 전자는 바닥 에너지 상태에서 높은 에너지 상태로 들뜸

3) 뜰든 상태는 이완과정을 통하여 에너지를 소비

4) 이완상태: 열발생, 현광 또는 인광의 방출

(4) 전자 전이의 종류

1) σ, π, n-전자전이 (S, P 궤도함수의 전이) (최신 기기분석학 p48, 그림 3-4)

a. 유기화합물의 원자내의 전자는 결합에 참여하는 형태에 따라 σ, n, π-전자로

구분

b. 결합 (안정, 낮은 에너지 준위)궤도에서 반결합 (불안정, 높은 에너지 준위) 궤도로 전이

c. 전이되는 결합의 종류 및 전이되는 전자의 종류에 따라 필요한 에너지가 다름, 즉, 특정한 원자단의 전자는 특정한 파장의 전자복사선을 흡수

d. 흡수하는 전자복사선의 파장으로 특정한 원자단의 유무 (물질분석) 및 흡수하는 양을 측정하여 특정 원자단의 농도를 확인

e. 일반적인 전자전이에 필요한 에너지 양

- n → π* : 105 Kcal 〉 (270 nm〈)

- n → σ* : 150 Kcal 〉 (185 nm〈)

- π → π* : 170 Kcal 〉 (165 nm〈)

- σ → σ* : 179 Kcal 〈 (165 nm 〉)

2) d, f-전자 전이

a. 원자량이 큰 원소는 최외각 전자로 d 및 f-전자궤도함수를 갖음

b. 이러한 전자 중에서는 자외선 및 가시광선의 영역의 에너지를 흡수하여

전자가 전이하는 것도 있음

3) 전하이동전이 (charge transfer transition)

Chromophore	Example	Excitation	λ_max, nm	ε	Solvent
C=C	Ethene	π ^__> π*	171	15,000	hexane
C≡C	1-Hexyne	π ^__> π*	180	10,000	hexane
C=O	Ethanal	n ^__> π* π ^__> π*	290 180	15 10,000	hexane hexane
N=O	Nitromethane	n ^__> π* π ^__> π*	275 200	17 5,000	ethanol ethanol
C-X X=Br X=I	Methyl bromide Methyl Iodide	n ^__> σ* n ^__> σ*	205 255	200 360	hexane hexane

(5) 발색단 (chromophore)

1) 전자전이를 일으키는 원자단

2) 유기물의 경우에는 작용기 (functional group)

3) 무기물의 경우에는 2원자 이상으로 된 음이온

(6) 조색단 (auxochrome)

1) 벤젠고리에 방향족 고리의 전자와 상호 작용할 수 있는 비결합 전자쌍을 포함하는 작용기가 치환된 경우에는 최대 흡수파장이 장파장쪽으로 이동되며 띠의 세기도 증가

2) 자외선 영역의 빛을 흡수하지 않으면서 최대흡수파장을 장파장쪽으로 이동 시키고 띠의 세기도 증가시키는 원자단

3. Lambert-Beer의 법칙

(Ref: http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/spec/beerslaw.htm)

(1) Lambert의 법칙

1) 빛의 흡수는 용액층의 투과 두께에 비례

2) 일정 강도의 빛에너지 P₁이 시료가 담긴 용기를 지나면서 빛의 산란, 흡수, 반사에 의하여 P₂로 감소

3) 투광도: P₂/P₁

4) 순수 투광도: P/P₀

5) 강도 P인 빛이 db 두께의 용액층을 지나면서 빛의 흡수로 빛의 강도가 dp 만큼 감소했다면 빛의 감소율 -dp/P는 용액층의 dp에 비례

- dp/P = k∙dp (k = 비례상수)

- 따라서 두께 b인 용액층을 통과하는 동안 흡수되는 빛의 양은,

∫dp/P = k∫db

[InP] = k[b]

InP₀ - InP = kb

In(P₀/P) = kb ( P/P₀= T, 투광도(transmittance))

In(1/T) = kb

(2) Beer의 법칙: 빛의 흡수는 시료 용액층의 농도에 비례

- 빛의 감소율 (-dP/P)은 용액의 농도와 비례

In(1/T) = k'bc

log(1/T) = k'bc/2.303

log(1/T) = A (흡광도), c= 용액의 농도, k'/2.303 = ε (몰흡수율)

A = εbc (Lambert-Beer 법칙)

(3) Lambert-Beer 법칙의 문제점

1) 물성적 요인: 용액의 농도가 높을수록 간섭현상 대문에 직선적인 관계의 한계가 있음

2) 기기적 요인

a. 복색광에 의한 오차: 실제로 단색광을 얻기가 어려움

b. 떠돌이 복사광에 의한 오차: 단색광은 산란광이나 떠돌이 복사광에 오염

c. 화학적 요인: 화합물의 여러 가지 반응에 영향을 받음

4. 기기장치

그림 1. UV-visible spectrophotpmeter의 외형적 모습

그림 2. UV-visible spectrophotpmeter의 내부구조

(1) 광원

1) 수소 방전관

a. 근자외선 파장영역 (165～375nm)에서 유용하게 사용

b. 유리재질의 사료용기 사용이 바람직

2) 중수소 방전관

a. 수소방전관과 비숫한 성질이나 빛의 세기가 약 3～5배 강함

b. 근자외선 및 가시광선의 모든 파장영역 (190～820nm)에서 널리 사용

3) 텅스텐 램프

a. 일반적으로 사용됨

b. 파장영역 (350～2,500nm)이 자외선과 근적외선 영역

c. 필라멘트의 온도는 약 2,870K

(2) 회절장치: 특정한 파장으로 분리시키는 장치

1) 회전발 단색화 장치

a. 300 ~ 2,000홈/mm (주로 1,200 ~ 1,400홈/mm)

b. 광학적으로 평편하고 깨끗한 표면위에 많은 수를 조밀한 간격으로 홈을

만들어 단색화

2) 프리즘 단색화 장치

프리즘을 사용하여 빛을 분산한 후, 필요한 파장의 빛을 선택하여 사용

(3) 흡수셀 (cell)

1) 석영: 자외선, 가시광선, 근적외선의 모든 영역에 사용

2) 유리: 가시광선 및 근적외선 영역, 근자외선 영역은 적절치 않음

3) 플라스틱: 근적외선 영역

4) 시판되는 흡수셀

① standard cell

② standard cell

③ standard cell screw cap

④ cylindrical cell

⑤ black masked semi-micro cell

⑥ flow cell

⑦ water jacketed cell

⑧ cylindrical cell screw cap

(4) 검출기 (detector)

1) 광전기 전지: 광자에 의하여 반도체로부터 방출되는 전자가 은박층에 집합되므로써 생기는 전위차를 측정하는 장치

2) 광전관: 세슘을 입힌 음극에 광자가 충돌하여 나오는 전자를 양극으로 모아

이 때 흐르는 전류를 측정하는 장치

3) 광전자증배관: 광음극에서 나오는 전자를 전기장에 의해 가속화시킴으로써 감도를 10⁶～10⁹증폭시키는 장치