생물기기분석학 수업노트-4: 세포구성물질-3 (단백질)


- 차 례 -


1. 아미노산의 성질

2. 단백질의 구조

3. 시료의 구성 단백질 분석 (two dimensional electrophoresis)

4. 단백질의 아미노산 구성성분 분석 (amino acid analyzer)

5. 단백질의 아미노산 배열 분석 (amino acid sequencer)



- 강 의 내 용 -


1. 아미노산의 성질

(1) 아미노산의 공통구조

   1) -COOH: 카르복실기

   2) -NH2: 아미노기

   3) -R: 아미노산의 성질을 결정


(2) 아미노산의 일반적 성질


(3) 아미노산의 분류

        (참고: http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid       

              http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Amino_acid)


  1) 비극성, 지방족 R기: 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프로린


  2) 극성, 비전하형 R기: 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민


  3) 방향족 R기: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판


  4) 플러스 전하 (+)의 R기: 리신, 아르기닌, 히스티딘


  5) 마이너스 전하(-)의 R기: 아스파라트산, 글루탐산


(4) 아미노산의 등전점

  1) 등전점 (isolelectric point)

      a. 완전히 이온된 쌍성 이온형으로 존재

      b. 아미노산의 실제전하가 0이 되는 점

      c. 실제 전하가 0이므로 전기장에서의 운동이 없음

      d. pI (isoelectric pH): 실제전하가 0이 되는 pH

 

  2) 아미노산의 pK1, pK2 및 pKr

     

Abbrev.

Full Name

Mass

Side chain

pK1

(α-COOH)

PK2

(α-NH3+)

pKr

(R)

pI

A

Ala

Alanine

89.1

hydrophobic

2.35

9.87

-

6.01

C

Cys

Cysteine

121.2

hydrophobic

1.92

10.70

8.18

5.05

D

Asp

Aspartic acid

133.1

acidic

1.99

9.90

3.90

2.85

E

Glu

Glutamic acid

147.1

acidic

2.10

9.47

4.07

3.15

F

Phe

Phenylalanine

165.2

hydrophobic

2.20

9.31

-

5.49

G

Gly

Glycine

75.1

hydrophobic

2.35

9.78

-

6.06

H

His

Histidine

155.2

basic

1.80

9.33

6.04

7.60

I

Ile

Isoleucine

131.2

hydrophobic

2.32

9.76

-

6.05

K

Lys

Lysine

146.2

basic

2.16

9.06

10.54

9.60

L

Leu

Leucine

131.2

hydrophobic

2.33

9.74

-

6.01

M

Met

Methionine

149.2

hydrophobic

2.14

8.72

-

5.74

N

Asn

Asparagine

132.1

hydrophilic

2.14

8.72

-

5.41

P

Pro

Proline

115.1

hydrophobic

1.95

10.64

-

6.30

Q

Gln

Glutamine

146.2

hydrophilic

2.17

9.13

-

5.65

R

Arg

Arginine

174.2

basic

1.82

8.99

12.48

10.76

S

Ser

Serine

105.1

hydrophilic

2.19

9.21

-

5.68

T

Thr

Threonine

119.1

hydrophilic

2.09

9.10

-

5.60

V

Val

Valine

117.2

hydrophobic

2.39

9.74

-

6.00

W

Trp

Tryptophan

204.2

hydrophobic

2.46

9.41

-

5.89

Y

Try

Tyrosine

181.2

hydrophobic

2.20

9.21

10.46

5.64


  3) pI의 계산


   

2. 단백질의 구조

(1) 1차 구조

    1) 펲타이드 결합에 의한 아미노산의 배열

    2) 이황화 결합에 의한 bridge 형성


   

(2) 2차 구조

    1) α-helix (α-나선형 구조)

    2) β-sheet (β-병풍 구조)

    

     

    

(3) 3차 구조: 기능을 갖는 최소 단위

    

(4) 4차 구조: 3차 구조 (subunit)가 2개 이상 모여 복잡한 기능


           

                      그림. 단백질의 1, 2, 3 및 4차 구조

3. 단백질 시료의 아미노산 종류 비교 (SDS-PAGE 및 2차원 전기영동)

(1) 전기영동

   1) 전기영동 (electrophoresis)

      a. 단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 하전을 띄므로 이를 기초로 하여 분리

      b. 이들 분자를 전기장을 띤 매질(겔)에서 이동 분리시킴

      c. 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법

        

   2) 젤 (gel)

      a. 아크릴아미드를 비스아크릴아미드로 결합시킨 중합체인 폴리아크릴아미드 겔

         을 가장 많이 사용함

      b. 폴리아크릴아미드 젤의 농도가 증가할수록 젤의 구멍의 크기가 작아짐

      c. 단백질의 분자량을 알아서 폴리아크릴아미드 겔의 농도를 결정

      d. DNA의 전기영동은 일반적으로 아가로오스 (agarose) 젤을 사용함

      e. DNA의 전기영동은 수평전기영동 (horizontal electrophoresis)을 이용함


(2) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)

      참고:http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/GE.swf 


   1) 폴리아크릴아미드 젤은 분자체(molecular sieve)의 역할을 하므로 각 단백질은 거의 그들의 질량에 비례하여 이동함

   2) 단백질을 이루는 대부분의 아미노산이 띄는 전하량의 정도가 다르기 때문에 단위 질량당 전하의 정도가 달라지고, 단백질 분자의 모양도 다양함

   3) 따라서 이동속도는 질량에 비례하지 않은 경우도 있음

   4) 분자량의 결정을 위한 전기영동은

        a. 음이온 세제인 sodium dodecyl sulfate(SDS)와 디설피드 결합(S-S bond)을 끊는   b. 2-메르캅토에탄올을 단백질 용질에 첨가해 줌으로써 가능함


   5) SDS는 단백질에 결합하여 원래의 전하에 관계없이 단백질 분자량에 비례하여 음전하를 가짐.

   6) SDS의 결합으로 단백질의 고유한 3차 구조를 잃고 linear 상태로 바뀜으로 분자량에 따라 분리가 됨.

   7) 단백질의 이동도가 각 분자량의 대수값에 비례하므로 분자량을 이미 알고 있는 표식단백질과 비교하여 분자량을 산출해 낼 수 있음



             

(3) 2차원 SDS-PAGE (IEF: isoelectric focusing)

   1) 비슷한 분자량의 단백질은 1차원 SDS-PAGE만으로는 효과적으로 분리할 수 없음

   2) 2차원 SDS-PAGE는 특정 단백질이 가지는 고유의 등전점 (pI)에 따라 1차 분리 한 후,

   3) 분자량에 따라 (SDS-PAGE) 2차 분리하는 것

   4) 1차 전기영동

      a. IEF는 pI(등전점)가 다양한 양쪽성 용매를 함유하는 gel에서 이루어짐

      b. 전하량에 따라 이동하는 단백질이 pH 구배를 형성하는 gel에서 net charge

         가 0이 되는 곳에서 정지함


   4) 2차 전기영동

      전하량에 의해 분리된 단백질은  다시 SDS-PAGE를 시행하여, 분자량에 의하여 분리함

       

            

        




4. 단백질의 아미노산 구성성분 분석: amino acid analyser

  참고: http://www.directindustry.com/prod/biochrom/amino-acid-analyzer-23613-80668.html

        (watch the video)

(1) 원리

   1) 이온교환 column에 의하여 각각의 아미노산을 분리함

   2) 분리된 아미노산을 Ninhydrin과 반응시킨 후, UV 검출기를 통하여 그 흡광도를 측정함

   3) 표준 아미노산의 분리 data와 비교하여 아미노산의 종류를 분석


(2) 분석법

   1) 단백질의 가수분해: HCl을 사용하여 단일 아미노산으로 가수분해

   2) 아미노산의 유도체 생성:

      


   3) 이온 교환 column을 장착한 HPLC (amnino acid analyzer)로 분리

   4) data 분석 및 계산: 특정한 단백질의 아미노산 조성비를 계산

       참고: http://www.hitachi-hitec.com/global/science/lc/l8900.html


5. 단백질의 아미노산 배열 분석: amino acid sequencer

(1) 원리

   1) 폴리펲타이드 (단백질)의 한쪽 말단부터 아미노산을 한 개씩 제거하면서 분리

   2) 분리된 아미노산의 종류를 HPLC로 분석하여 전체 아미노산의 배열을 결정

    (참고: http://www.biotech.iastate.edu/facilities/protein/nsequence494.html)


(2) 분석 방법

   1) 분석하고자 하는 단백질을 PITC (phenylisothiocyanate)와 반응

        PITC + 폴리펲타이드 →  PITC-NH-aa1-aa2-aa3-....aan-COOH


   2) TFA (trifluorocaetic acid) 처리: 폴리펲타이드에서 첫 번째 아미노산 분리

        PITC-NH-aa1-aa2-aa3-....aan-COOH →

        PITC-NH-aa1-COOH + NH2-aa2-aa3-....aan-COOH


   3) 분리된 아미노산과 나머지 폴리펲타이드의 분리: gel permeation column 사용

   4) 분리된 아미노산의 종류 분석

        a. 이온교환 column을 장착한 HPLC를 사용하여 분석

        b. 표준 아미노산의 chromatogram과 비교하여 분리된 아미노산의 종류 결정


   5) 원래 길이의 폴리펲타이드에서 N-teminal의 아미노산 한 개가 제거된 폴리펲타이도

      위의 방법으로 계속하여 분석

   6) 분석결과로 폴리펲타이드의 아미노산 서열을 결정