생물기기분석학 수업노트-9: 크로마토그라피
- 차 례 -
1. 개론
2. 크로마토그라피의 분류 (이동상에 의한 분류)
(1) GC (gas chromatography): 이동상이 기체
(2) LC (liquid chromatography): 이동상이 액체
(3) SFC (supercritical fluid chromatography): 이동상이 초임계 유체
3. GC의 분류 (정지상에 의한 분류)
(1) GSC (gas-solid chromatography)
(2) GLC (gas-liquid chromatography)
4. LC의 분류 (구조상의 분류)
(1) plane (판) 사용
(2) column 사용: HPLC (high performance LC)
5. HPLC의 분류 (정지상의 종류에 의한 분류)
(1) LSC (liquid-solid chromatography)
(2) LLC (liquid-liquid chromatography): 정지상이 고체에 흡착된 액체
- 강의 내용-
1. 개론
(1) 두 가지 이상의 성분으로 된 물질을 단일 성분으로 분리
(2) 고정상과 이동상에 따른 흡착계수 및 분배계수의 차이에 의한 분리
(3) 이동속도의 차이에 의한 혼합물의 분리
(4) 각 성분을 정성 및 정량적으로 분리
2. 크로마토그라피의 분류
(1) GC (gas chromatography): 이동상이 기체
(2) LC (liquid chromatography): 이동상이 액체
(3) SFC (supercritical fluid chromatography): 이동상이 초임계 유체
3. GC의 분류 (정지상에 의한 분류)
(1) 일반적 형태
1) 운반가스 (carrier gas) 및 용기
2) 유량 및 압력조절기 (flow and pressure regulator)
3) 시료주입구 (injection port)
4) 분리관 (column)
5) 검출기 (detector)
6) 기록기 (recorder)
7) 온도조절기 (thermostated heating zone)
그림 1. GC 컬럼(왼쪽)과 LC 컬럼(오른쪽)의 비교
(2) GSC (gas-solid chromatography)
1) 기체-고체 크로마토그라피
2) 정지상의 고체물질에 흡착 (adsorption)하는 메카니즘
3) 기체-고체 흡착평형이 분리과정의 기본
4) 주로 기체 분석에 이용
5) 분리관 (컬럼, column)의 충전 물질: 실리카겔, 분자체, charcoal 및 porapak
(3) GLC (gas-liquid chromatography)
1) 기체-액체 크로마토그라피
2) 정지상에서 분배 (partition)가 메카니즘
3) 정지상은 불활성인 고체 지지체에 얇은 막으로 입혀진 액체상
4) 많은 종류의 액체상을 이용할 수 있음
(4) GC와 GC/MS의 관계
4. LC의 분류 (구조상의 분류)
(1) plane (판) 사용
1) PC (paper chromatography): 정지상이 거름종이
2) TLC (thin layer chromatography): 정지상이 유리판 위에 입힌 분말
(2) 컬럼 사용: HPLC (high performance LC)
5. HPLC의 분류 (정지상의 종류에 의한 분류)
(1) LSC (liquid-solid chromatography)
1) adsorption chromatography
a. 정지상이 고체 흡착제
b. 분리 메카니즘은 흡착
c. 약한 Van der Waals force에 의해 용질을 고체상의 흡착체에 흡착시키는 것
d. 흡착체
- 활성탄, aluminium oxide, magnesium oxide와 실리카 겔
- 다공성 유기수지(macro-porous resin)
e. 흡착 크로마토그래피는 주로 경험적으로 결정
2) ion-exchange chromatography
a. 정지상이 이온교환수지 (양이온 또는 음이온)
b. 분리메카니즘은 이온교환
c. 양이온 교환수지
- 이온 교환체
∙ sufonic acid, carboxylic acid, 포스폰산(phosphonic acid)
∙ 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxy-methyl cellulose)
- 양이온으로 하전된 용질이 음이온으로 하전된 수지에 결합
d. 음이온 교환수지
- 이온 교환체
∙ secondary amine, quaternary amine, 4차 암모늄
∙ DEAE(diethylaminoethyl) 셀룰로오스
- 음이온으로 하전된 용질이 양이온으로 하전된 수지에 결합
3) size-exclusion chromatography
a. gel permeation, gel exclusion 등으로도 알려져 있음
b. 겔여과는 분자들의 크기 차이를 이용하는 분리 기술
c. 물질의 크기 (분자량)에 따른 물질의 분리
d. 다공성 고분자로 채워진 컬럼을 사용
e. 물질의 크기가 큰 것일수록 컬럼을 통과하는 시간이 빠름
f. 작은 크기의 분자는 컬럼에 채워진 겔 속으로 빨리 확산되어 겔 속으로 침투
g. 완충용액 등을 사용하여 용출이 시작되면 큰 분자들은 먼저 용출
h. 작은 분자는 침투한 겔을 통과한 후, 용출되므로 큰 분자에 비하여 늦게 용출
i. 겔의 종류
- 분자량별로 분리하기 위하여 다양한 세공크기(pore size)를 갖는 물질
- 화학적으로 교차결합된 텍스트란(dextran)과 아가로오스(agarose) 등을 사용
4) 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)
a. 대부분의 생체고분자들이 갖고 있는 기능 또는 화학구조에 근거하여 분리
b. 생체고분자들 사이의 대단히 특이적인 상호작용을 이용
- 효소-기질; 효소-저해제; 항원-항체
c. 특정한 물질이 결합기와 선택적으로 흡착
d. 특정한 물질과의 친화성이 리간드 (고정체) 보다 높은 물질을 컬럼에 통과
e. 특정한 물질은 리간드에서 떨어져 컬럼 밖으로 용출
f. 장점: 매우 순도가 높은 생체고분자를 얻을 수 있음
g. 단점: 비용이 많이 들고 시간도 많이 필요
f. 고정상 (리간드)는 항체, 효소 및 렉틴 등을 사용
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/Affinity.html
5) 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography)
a. 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)
b. 친수성기를 소수성 알킬사슬로 치환시킨 리간드를 지지체에 붙여 사용
c. 소수성이 강한 물질이 리간드에 더 강하게 결합됨으로써 소수성이 나중에 용출
d. 소수성이 약한 물질이 리간드에서 먼저 떨어지므로 먼저 용출
e. 알킬기는 탄소수가 8개 또는 18개인 것을 사용하며 단백질과 펲타이드 등을 분리
(2) LLC (liquid-liquid chromatography):partition chromatography
a. 정지상이 액체 (액체정지상이 지지체에 coating되어 있음)
b. 정지상과 고정상은 혼합될 수 없는 액체를 사용
c. hydrophobic chromatography
6. HPLC colulmn의 예
(1) ion exchange chromatography
(2) Affinity chromatograohy
