동물실험법
- 실험동물의 개체 식별법
- 색소도포법 : 피모에 색소를 칠해서 구별하는 방법으로 머리, 등, 허리, 대퇴부, 다리 등을 조합하여 사용, picric acid(황색), fuchsin(적색), methylene blue(청색)
- Ear punch법 : 귀에 구멍을 뚫어서 식별하는 방법, 1-99까지 식별가능, 마우스, 랫드, 기니픽 등에 사용
- 표지판 사용 : 번호가 찍혀 있는 알루미늄판을 목에 걸어주는 장치, 개, 고양이, 원숭이 등에 사용
- 입흑법 : 문신과 같은것, 종생식별에 사용
- 기타 : 발가락을 잘라서 구별하는 방법
- 채혈법
- 채혈 부위와 채혈량
- 안와정맥총 채혈법
- 랫드의 후대정맥과 복대동맥 혈관모식도
- 투여법
- 경구투여법 : 존대를 사용하는 방법
- 1회 투여량 : 마우스(5-10ml/kg), 랫드(10-20ml/kg)
- (주의) 주사기를 한번 잡아 당겨 공기가 따라 올라오지 않는 것을 확인 후 투여
- 정맥내 투여법
- 정맥내 투여에 이용되는 정맥
- 마우스 : 미정맥
- 랫 드 : 미정맥, 후지말초정맥
- 토 끼 : 후이개정맥
- 햄스타 : 후지말초정맥
- 기니픽 : 후지말초정맥
- 복강내 투여법
- 피하 투여법 : 목부위, 등부위, 좌우 복부 등에 주사
- 근육내 투여법 : 둔부나 대퇴부를 사용
- 피내 투여법 : 투베르쿨린반응 등 면역 알레르기 실험에 많이 사용되는 방법
- 마우스, 랫드, 햄스타 : 등쪽피부, 미근부
- 기니픽, 토끼 : 이개
- 원숭이 : 상안검
- 0.2ml정도 투여가능
- 뇌내투여법 : 2단침 사용
- 주사부위 : 마우스, 랫드에서 양안와후선을 잇는 선상의 정준선에서 조금 떨어진 곳
- 주입량 : 마우스(0.02-0.03ml), 랫드(0.05-0.1ml)
- 마취법
- 전신마취법
- Sodium pentobarbital : 쥐에 주사용으로 가장 널리 사용
흡입 마취보다 단일 주시로써 좋은 근육 이완을 일으키고 깊은 수면상태를 일으킨다.
복강 주사로써 15-60분, 근육 내 주사로써 1.5-2시간 동안 지속시킬 수 있다
수면 유도 시간은 복강 주사 후 5-20분, 근육 주사 후 최소한 30분이다
에테르 마취와 반대로 기관지 분비액이 심하지 않다
사용량은 체중과 상관관계가 있으며 충분한 마취량은 치사량과 매우 가깝기 때문에 체중 대비 정확한 사용량을 결정해야 한다.
같은 체중의 쥐라도 같은 양에 대하여 반응 차이를 보일수 있다.
비교적 빈약한 의식 상실 효과를 보이고, 혈압과 뇌내 혈류의 감소를 일으킬 수 있다
심한 호흡 억압이 있을 수 있으므로, 필요하다면 황산 아트로핀을 미리 처리하면 다소 경감 시킬수 있다
수술후 소생이 느리다.
정상적인 마취량에도 쥐가 치사할 때가 있으므로 최소마취량의 2/3 주사하고 수술대 위에서 심마취는 에테르 흡입 마취로 계속하여 실시하는 것이 더 안전하다
쥐가 회복 증상을 보일 때는 처음 사용양의 1/4 을 추가 주사하여 마취 시간을 연장시킬 수 있다
약 4시간까지의 안전한 마취 시간의 연장은 펜토바비탈을 위내외 복강 내에 동시 투여함으로써 성취할 수 있다
- Avertin(Aldrich Chemical Co.) : Rat 및 Mouse embryo 이식, 정관 절제 수술 및 난소 절제 수술에 이용된다
- 마취제의 기화가스를 흡입하는 방법
- 에테르
- 간편하고 경제적이고 사용량이 체중과 관계 없다. 근육 이완이 신속하고도 효과적으로 일으킨다. 마취 상태의 조절이 쉬우며 약 2시간까지 가능하다.
수술 후의 회복이 빠르다. 염증 작용이 있고, 폭발적이다.
타액 분비가 많다. 호흡 기도에 대한 자극으로 기도 감염증의 소인이 될 수 있다.
- 살 처 분
- 탄산가스흡입법 : 탄산가스는 공기보다 무겁고, 무색무취하며, 저렴하다. 기존의 에테르, 클로로포름(인체에 유해)등이 비해 안정성 높다.
- 경추탈구법
- 단두대
- 마취제 과량투여에 의한 살처분 : pentobarbital sodium
면역부전동물 사육 및 실험관련기술
- 면역부전동물의 사육관리
- 사육관리 : 면역부전동물(Nude 및 SCID mouse)의 사육관리는 다른 실험동물의 사육관리와 기본적으로 다를 것이 없다. 특히, 미생물 감염의 예방면에서 SPF동물의 사육관리와 같은 방법으로 행한다면 용이하게 사육관리할 수 있다.
- 사육시설 : 면역부전동물의 사육관리에는 원칙적으로 SPF동물 사육시설내에 clean rick 또는 isolator를 설치하여 사육하는 것이 바람직하지만, 일반적으로 SPF시설내에서 일반적인 사육 rack을 사용한 사육도 가능하다. 유지 및 생산을 위한 시설은 기밀성이 놓은 구조 이어야하고 복도는 물로 씻을 수 있도록 방수재질로 배수구를 설치한다. 기본적으로 공조시설은 완벽하여야하며, 온도 21도 상대습도55%
의 범위로 통제하고 환기는 1시간에 적에도 6회 이상이어야 한다. 공조기는 24시간 연속 운전이며, 고장시를 대비하여 충분한 보완대책이 필요하다. 기타 Autoclave, pass box, pass room 등을 설치 하여야 하며, Autoclave는 사육 cage 등의 멸균에 항상 사용하기 위해 가능한한 큰것이 좋다.
- 기구, 기자재 : 사육 케이지는 고압멸균에 잘 견디는 재질을 사용하고, 물병은 유리 또는 플라스틱의 고압증기 멸균에 견디는 재질을 사용한다. Clean rack은 투명한 슬라이드문을 사용한 반 밀폐형으로 각각의 단에 청정한 공기가 흐르게 하여야 하며, 기타 소모품(깔짚, 사료)들은 멸균 및 방사선 멸균을 한다.
- BALB/c-nu mouse의 계통 유지법
- Cross-Intercross 방법에 의한 BALB/c-nu계통유지
- 현재 상품화된 누드 마우스의 종류
C57BL/6J-nu, BALB/ccBYJ-nu, NU/J, CByB6F1/J-nu, B6CByF1/J-nu
- BALB-nu mouse의 대량생산 방식
- SCID mice계통유지 및 생산
면역기능이 결핍된 SCID(severe combined immunodeficiency) mice를 계통 보존 하기 위해 C.B-17 scid/scid를 C.B-17 +/+와 주기적으로 역교배하여 Genetic drift를 막아야 한다. SCID mice를 다양한 실험에
이용하기 위해서는 혈중의 immunoglobulin의 량을 측정 하여야 하는데 혈중의 Ig양이 혈청1ml당 50마이크로미만인 nonleaky 상태의 동물이어야만 SCID로서 가치가 있는 것이다.
- C.B-17 SCID mice의 계통 유지법 --------------그림(p91)
- Immunoglobulin test
- Sandwich ELISA의 원리
- Sandwich ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 실험 방법
- 채혈 및 혈청 분리 : capillary tube을 이용하여 후안와정맥총(postocular venous plexus)에서 채혈한 후 혈청을 분리 하였다.
- ELISA용 plate 제조 : ELISA용 plate를 제조하기 위해 unconjugated goat anit-mouse IgG를 carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)로 각각 농도별로 희석하여 각 well에 100마이크로씩 침척한 후 4도에서
하룻밤 동안 정치하여 제조한다.
- Sandwich ELISA과정 : ELISA용 plate를 제조한 후 washing buffer(PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20)로 1% Bovien serum albumin을 제조한 후 100마이크로씩 침척하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이 반응을 억제한다.
0.1% BSA와 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 피검 혈청을 단계별로 희석한 후 100마이크로씩 가하여 실온에서 1시간동안 반응 시킨다.
반응 후 peroxidase labelled rabbit anti-mouse IgG(Pierce)를 PSB(0.1% BSA, 0.05% Tween 20)로 농도별로 희석한 후 100마이크로 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨다.
반응 후 substrate로 OPD(o-Phenylenediamine-Dihydrochloride, Sigma, MO, USA)를 well당 200마이크로 넣어 dark room에서 30분 동안 발색시킨 후 3M sulfuric acid을 50마이크로씩 넣어 반응을 정지 시킨다.
반응 plate는 automated ELISA plate reader(Flow Lab., Lugano, Switzerland)를 이용하여 발색시킨 후 450nm에서, 반응정지액을 가한 후 492nm의 자외선 파장하에서 흡광도를 측정한다.
음성 대조 혈청으로는 PBS를 사용하며 washing buffer로 반응간에 충분히 세척한다.
IgG정량 : SCID mice의 혈청중의 IgG를 정량하기 위해 whole mouse IgG(Pierce)를 이진희석하여 위의 방법에 의해 sandwich ELISA를 실시한 후 standard curve를 만들어 C.B-17 및 C.B-17 SCID
mice 혈청중의 IgG를 정량 하였다.
- 현재 상품화된 SCID mouse의 종류
C.B-17-scid, NOD/Lt-scid/Sz, C3HSmn.C-scid, BALB/cByJSmn-scid/J, C57BL.6J-scid/SzJ